制药行业正期盼着一种更有效、可持续和环保的技术来合成那些能够拯救生命的治疗物，比如某些复杂的多肽。使用传统的固相多肽合成技术(SPPS)和重组表达法在多肽产品的纯度和可持续性方面存在许多局限性。宝欧信特公司(Biosynth)的化学酶促肽合成(CEPS)技术是一项具有经济性、规模化和环境可持续能力的开创性技术。从成功合成线性治疗肽，如艾塞那肽（Exenatide）和胸腺素（Thymosin-α1)到环状肽(如MCoTI-II)， 标志着CEPS技术已经成为多肽治疗领域的突破性技术。

多肽合成技术的研发

纵观整个20世纪，与日俱增的多肽治疗需求加速了多肽合成技术的发展。胰岛素的应用就是一个非常有代表性的例子。值得注意的是，胰岛素于1921年首次从天然来源中分离出来，是第一个用于治疗糖尿病的多肽药物。自这一开创性的发现被商业化以来，许多具有生物活性的肽，如促肾上腺素等逐一被分离提取出来。而随着多肽合成技术的发展，多肽合成药物也得到了发展。诸如重组人胰岛素和合成抗利尿激素被开发出来，因为仅仅从天然来源分离提取的胰岛素已无法满足市场需求。

SPPS固相多肽合成技术

SPPS最初由Robert Bruce Merrifield在20世纪60年代研发成功，该技术现已被广泛应用于分步合成精确的多肽序列。也就是将一部分可从多肽链c端进行延伸的氨基酸固定在特定载体上，以此作为肽合成的平台，同时也便于去除多余的试剂和副产物。虽然这一过程使肽和蛋白质的合成更容易和有效，但合成复杂的多肽分子则比较困难，并且随着肽链长度的增加而导致更高的杂质含量。此外，与生物催化方法相比，SPPS在二氧化碳排放和耗材使用方面不具优势。

重组表达

另一种解决方案是多肽的重组表达技术，即利用基因工程微生物，如细菌或酵母表达和生产所需的肽，该技术已可实现复杂多肽的规模化生产。但是该技术不能满足可溶性多肽的合成，对此技术人员还需要进行大量的研发工作，并对每个新序列进行改进。此外，重组蛋白的翻译后修饰也是一大难题，因此最新的解决方案是使用一种名叫化学酶促肽合成的技术CEPS。

CEPS化学酶促肽合成

化学酶促肽合成(Chemo-Enzymatic Peptide Synthesis, CEPS)是一种利用特定的酶来连接较短的肽序列，从而生成较长的肽和小蛋白质的新技术。值得关注的是，利用该技术可以合成超过100个氨基酸的环肽和多肽序列，且纯度高，易于肽链扩展。不仅如此，独特的CEPS酶对一系列侧链具有出色的耐受性，使得该技术广泛适用于功能化肽序列的合成。

总体而言，CEPS技术为肽合成提供了一种可持续、更高效、更环保的方法，而酶的优异特性能赋予了这项技术诸多优点和可能性。该酶源自枯草芽孢杆菌(一种安全的GRAS生物)的无内毒素代谢过程，能在pH值7至8.5的水环境中表达出酶活性。由于酶在变性剂和有机共溶剂存在的情况下保持活性和稳定性，从而使得疏水肽和折叠肽的连接成为可能。更重要的是，该酶能够识别多种氨基酸序列从而匹配多种不同的底物，而无需插入特殊的标记物序列。正因为这种特性，CEPS被认为是一种“无痕技术”。

CEPS相比重组表达技术的优势

Biosynth CEPS技术的关键特性

· CEPS合成的多肽长度远超出SPPS 所能达到的80 aa水平

· 在合成复合多肽时，CEPS显著高于SPPS (>2x)的产率

· 更高纯度产品-待连接片段可经事先纯化，从而获得比SPPS更纯的产品。

· 能够合成目前市面上超过90%的药用肽

· 该技术可用于不同有效载荷通过Linker连接蛋白质的研究。

· 大分子肽主链环化(大于12aa 's)。其他技术路线需要使用半胱氨酸(NCL)或低溶解度的受充保护线性前体。

· 能够合成环肽，包括具有三个二硫桥的环状肽，结状结构等

· 可用于连接Linker系统，即把非天然片段连接在一起以合成生物偶联物和抗体药物偶联物

CEPS的工作原理

CEPS技术的核心是一种具有半胱氨酸活性位点的基因工程酶。如上所述，该酶可识别多个氨基酸序列，而无需插入特定的标记物序列。

合成一段肽链至少需要两个片段，一个酯基片段和一个胺基片段。半胱氨酸活性位点与酯基片段(特指酯的羰基部分)发生反应，酯基片段通过共价键连接到酶上，同时一分子有机醇脱离该活性位点。接着胺基片段进入该活性位点，游离胺基与硫酯键反应。这种方式在能量上非常利于形成带有酰胺键的产物。在合适条件下，酶可以继续捕捉下一个底物，重复上述步骤并形成为新的胺基片段。

CEPS的工作原理

CEPS技术涉及的酶需要六个氨基酸进行识别和对接。其中四个在酯基片段中，另两个在胺基片段中。如前所述，这些氨基酸并不是固定组合或某种独特序列，因为CEPS酶能适配各种不同的底物。但如果合成的最终产物是环状肽的话，则需要12个氨基酸参与其中，其中六个用于识别，六个用于闭环。

CEPS技术的成功案例

作为一项全新的技术，CEPS已经在多肽和蛋白质合成领域占据了主导地位。CEPS适用于合成长度超过60个氨基酸的多肽、趋化因子、细胞因子、纳米体和非抗体(小)蛋白支架。这其中许多蛋白质可以用作关键的多肽治疗药物，引领医学的进步。迄今为止，CEPS已成功合成利拉鲁肽(CRB1001347)、司美格鲁肽 (FS171058)、艾塞那肽(FE31731)、MCoTI-II和胸腺素-α1 (FT109993)。

例如胸腺素-α1，它可以通过连接两个肽片段来合成。胸腺素-α1是一种具有免疫调节活性的28-聚体治疗肽。目前，它被用于乙肝和丙肝等疾病的治疗，并“在30多个国家获得批准”(Schmidt, 2018)。为了满足对胸腺素-α1的高需求，人们通常采用固相法和液相法扩大胸腺素-α1的合成。尽管如此，上述方法的总产量依然很低。这是因为合成胸腺素-α1需要大量的保护基团，并且不可避免会产生β-片段，这增加了合成的难度。另外采用原核或真核表达技术时，成品的滴度较低，分离纯化难度较大。如今CEPS技术为胸腺素-α1的合成提供了一种更高效且经济的解决方案，该方案将两个14聚体连接在一起。从而实现克级规模的生产，偶联收率为94%，产量提高了55%。CEPS这项尖端的技术，为多肽合成和治疗行业提供了令人瞩目的支持和服务(Schmidt, 2018)。

另一个CEPS的成功案例是艾塞那肽的合成。Exenatide是一种39聚体GLP-1激动剂，是抗糖尿病药物Bayetta®和Bydureon®的药物中间体(API)。使用CEPS技术，可以无缝实现50克以上规模的艾塞那肽的生产 (Pawlas, 2019)。

CEPS技术不仅可以用于生产线性肽，而且还可以合成富含二硫化物的大环肽(cyclotides)，这种肽在治疗方面具有很大的潜力。这是由于与同类线性肽相比，大环肽表现出更高的代谢稳定性和药效。这些环核苷酸架构也可以用作生物活性表位的结构性支架，进一步印证了它们在药物领域潜力。例如Momordica cochinchinensis胰蛋白酶抑制剂- ii (MCoTI-II)就是这样一个例子。MCoTI-II作为一种环状肽支架，可用来固定COG肽。COG是SET的拮抗剂，而SET通常会在癌细胞中过度表达。环状肽结构增加了COG肽的稳定性，使得整个结构对癌细胞系产生了细胞毒性(D'Souza, 2016)。，目前科研人员已使用CEPS技术对多肽进行环化，成功生产出了MCoTI-II这种环状34聚体(Schmidt, 2019)。

CEPS还可以用来合成细胞因子，以调节免疫系统，细胞因子可将自身作为免疫疾病治疗的潜在候选物或靶点。因此，CEPS技术对于研究细胞因子在健康和疾病过程中的作用有着非常重要的地位。

CEPS这项突破性的技术切实推动了科学研究和医学进步，它充分展现了在合成复杂药物肽方面的实力。作为一个技术创新者，Biosynth致力于为科学家提供最有效和最前沿的技术。我们所提供了CEPS技术，不断拓展长肽和小蛋白合成的可能性。欢迎访问我们的CEPS技术网页或直接联系我们，定制您的肽项目。

利拉鲁肽 (CRB1001347), https://www.biosynth.com/p/CRB1001347/liraglutide

司美格鲁肽(FS171058), https://www.biosynth.com/p/FS171058/910463-68-2-semaglutide

艾塞那肽 (FE31731), https://www.biosynth.com/p/FE31731/141758-74-9-exenatide

胸腺素-α1 (FT109993), https://www.biosynth.com/p/FT109993/1337515-90-8-thymosin-alpha1-trifluoroacetate

化学酶促肽合成技术介绍(CEPS) https://www.biosynth.com/peptides/CEPS-technology

参考文献

D'Souza, C., Henriques, S. T., Wang, C. K., Cheneval, O., Chan, L. Y., Bokil, N, J., Sweet, M. J., Craik, D. J. (2016) Using the MCoTI-II Cyclotide Scaffold To Design a Stable Cyclic Peptide Antagonist of SET, a Protein Overexpressed in Human Cancer. Biochemistry, 55(2): 396-405.

Pawlas, J., Nuijens, T., Persson, J., Svensson, T., Schmidt, M., Toplak, A., Nilsson, M., Rasmussen, J. H. (2019). Sustainable, cost-efficient manufacturing of therapeutic peptides using chemo-enzymatic peptide synthesis (CEPS). Green Chemistry, 21(23), 6451-6467.

Schmidt, M., Huang, Y-H., Rexeira de Oliveria, E. F., Toplak, A., Wijma, H. J., Janssen, D. B., van Maarseveen, H. J., Craik, D. J., Nuijens, T. (2019) Efficient Enzymatic Cyclization of Dislfide-Rich Peptides by Using Peptide Ligases. ChemBioChem, 20, 1524-1529.

Schmidt, M., Toplak, A., Rozeboom, H. J., Wijma, H. J., Quaedflieg, P. J. L. M., van Maarseveen, J. H., Janssen, D. B., Nuijen, T. (2018). Design of a substrate-tailored peptiligase variant for the efficient synthesis of thymosin-α1. Organic and Biomolecule Chemistry, 16(4), 609-618.

Wang, L., Wang, N., Zhang, W., Cheng, X., Yan, Z., Shao, G., Wang, X., Wang, R., Caiyun, F. (2022). Therapeutic peptides: current applications and future directions. Signal Transduction and Targeted Therapy, 7(48).